▏ 名詞定義

▏ 工作原理

     
      體外電穿孔時，將靶細胞懸浮液與待導入細胞的質粒DNA在導電溶液中混合，然后放入比色皿中（圖1）。電穿孔比色皿的樣品室兩側各有一塊金屬板，電流可以通過混合物。將比色皿放入電穿孔儀的腔室中，該腔室配有相應的電觸點，使比色皿形成電路。電穿孔儀上的控制器允許用戶設置待輸送電脈沖的電壓、波形和持續(xù)時間，這些參數(shù)應根據(jù)靶細胞類型進行優(yōu)化。然后，電脈沖通過樣品室。

▏ 優(yōu)缺點

優(yōu)點	缺點
操作相對簡單	需要專用儀器
對轉染難度較大的細胞類型效果良好	參數(shù)必須經(jīng)過仔細優(yōu)化
無載體要求，甚至不需要載體	對細胞損傷較大，部分無法恢復而死亡
對細胞類型的依賴性小	/
快遞轉染大量細胞，相對成本低	/
可以轉染含有細胞壁的物種	/

▏ 關鍵參數(shù)

      制定電穿孔方案時，重要的是選擇合適的參數(shù)，使其能夠實現(xiàn)通透性，同時最大程度地減少對細胞膜的干擾，以最大限度地提高細胞活力、實驗可重復性和效率。需要考慮的因素包括：

1. 波形：指數(shù)衰減脈沖、方波脈沖

方波脈沖迅速上升到設定電壓，維持該水平，然后在脈沖結束時迅速截止；指數(shù)衰減波的電壓迅速上升到目標值，然后隨時間下降。一般而言，哺乳動物轉染選擇方波脈沖比較多；

2. 脈沖時間：針對方波脈沖，一般是直接設置持續(xù)時間；指數(shù)衰減脈沖會隨著時間延長，電壓逐漸降低，一般用時間常數(shù)TC表示，需要結合對細胞的損傷來優(yōu)化；

3. 場強：指施加于電極間隙的電壓，這個電壓跟很多因素有關，比如比色皿的間隙、細胞的大小、溫度等。

4. 緩沖液：緩沖液的電阻、鹽濃度、緩存能力都會影響電轉效果，比如有些敏感細胞更喜歡培養(yǎng)基組份；

5. 溫度：高功率一般傾向于低溫，比如冰上操作；

6. pH變化：電極電解可能引起pH變化，可以通過緩沖液調(diào)整；

7. 細胞數(shù)量：細胞過密會導致電弧放電，過稀會降低陽性比率；

8. 細胞質量：因為電轉本身對細胞有損傷，因此被電轉的細胞質量尤為重要，一般是選擇健康、無污染、分裂活躍、代數(shù)低的細胞；

9. 質粒質量：質量差或者污染的質粒DNA會降低電轉效率；

其他：比色皿表面的水份、高鹽、氣泡等，都可以引起電弧放電。

 

▏ 瞬時表達和穩(wěn)定整合

▏ 應用場景

1

瞬時轉染，追求瞬間高拷貝/超拷貝的蛋白表達；

2

穩(wěn)定細胞株構建，生物安全等級低，對整和效率、整合位置要求不高。


 

▏ 穩(wěn)定細胞株構建服務

科佰生物提供“質粒電轉整合系統(tǒng)”穩(wěn)定細胞株構建服務，利用該系統(tǒng)，我們已經(jīng)成功構建超過300株穩(wěn)定細胞株的模型，有著豐富的經(jīng)驗，歡迎溝通咨詢。

		質粒轉染		病毒感染	Flp-FRT系統(tǒng)	轉座子系統(tǒng)	基因編輯
		脂質體	電轉	慢病毒
適用細胞		部分細胞	幾乎所有細胞	幾乎所有細胞	內(nèi)部4種細胞	幾乎所有細胞	部分細胞
轉染/感染效率		低	中	高	高	高	低
隨機整合		是	是	是	否	-	否
生物安全等級		BL1	BL1	BL2	BL1	BL1	BL1
基因裝載能力		-	-	<4-5k	-	-	-
陽性率		低	高	高	高	高	低
周期	基因合成	2-3周	2-3周	2-3周	2-3周	2-3周	2-3周
	病毒包裝	-	-	1周	-	-	-
	混合克隆篩選	1-2周	1-2周	1-2周	1-2周	1-2周	1-2周
	單克隆篩選	>3 周	>3 周	>3 周	可選	可選	>3 周
	合計	> 8-10 周	> 8-10 周	>9-11周	5-7 周	5-7 周	> 8-10 周
工作負荷		高	中	中	低	低	高